細胞命運轉變以及響應外界信號的過程中會改變細胞類型特異（cell-type-specific）的基因表達，而基因表達的豐度(total RNA level)是由mRNA轉錄、加工、降解等過程共同決定的。

在含有多種細胞類型的復雜組織和系統(tǒng)中，在單細胞水平準確測定這些 mRNA動態(tài)變化過程對于理解基因表達調控的重要性不言而喻。

傳統(tǒng)的mRNA代謝標記技術利用尿苷類似物4-硫尿苷（4sU）可以有效的標記新生mRNA，但是技術上的局限性不能達到單細胞分辨率；而常規(guī)單細胞轉錄組測序技術雖然可以揭示不同細胞類型的穩(wěn)態(tài)轉錄組，但是不能準確分辨特定時間里新生成的和已有的mRNA，因此用于定量研究細胞類型特異的mRNA動態(tài)調控機制十分困難。

為了應對這一挑戰(zhàn)，美國賓夕法尼亞大學吳昊實驗室開發(fā)了一種高通量檢測單細胞mRNA動態(tài)變化的新方法， scNT-seq（全稱single-cell metabolically labeled new RNA tagging sequencing）。

該方法創(chuàng)新性的整合了mRNA代謝標記 (metabolic labeling)，基于液滴微流控（droplet microfluidics）的高通量單細胞轉錄組分析技術和近開發(fā)的4sU化學轉化反應 （chemically recode 4sU to cytosine analog）；在數據分析方面，作者構建了基于unique molecular identifier (UMI) 的統(tǒng)計模型來更加準確地分析單細胞水平上新生成的mRNA的比例。

北京時間2020年8月31日晚23時，Nature Methods雜志在線發(fā)表了文章 “Massively parallel and time-resolved RNA sequencing in single cells with scNT-seq”。

作者應用這一技術解析了小鼠神經元快速激活過程中的單細胞基因調控網絡并預測細胞狀態(tài)變化軌跡，他們還進一步研究了不同胚胎干細胞狀態(tài)轉換過程中的mRNA動態(tài)變化的調控機制。

scNT-seq具體技術流程如下：首先將4sU添加到培養(yǎng)基中用來標記細胞中新生成的mRNA（圖1第1步）。為了在單細胞轉錄組中區(qū)分含有4sU標記的轉錄本，將4sU化學轉化反應整合到液滴微流控 (Drop-seq) 流程中（圖1第2-4步）。

由于捕獲mRNA的barcoded beads具有區(qū)分不同轉錄本的UMI序列，相比較沒有UMI的單細胞分析技術（e.g. scSLAM-seq），該方法不僅可以消除由于PCR擴增帶來的誤差，而且相對于單個mRNA分子而言能增加T-to-C的覆蓋度（圖1第5-8步）。

后，利用基于UMI的二項式混合分布來準確估計每個細胞中單個基因的新生轉錄本。（圖1第9步）

圖2 利用scNT-seq技術研究小鼠大腦皮層神經元中神經活性調控的轉錄動態(tài)。

前人的研究表明，神經元激活后可以快速誘導（幾分鐘到幾小時內）幾百個特異基因表達，這些基因被稱為神經活性調節(jié)的基因（Activity-regulated genes， ARGs）。

利用ARGs被神經活性快速誘導而在靜息狀態(tài)下幾乎不表達的特點，可用其評估scNT-seq技術檢測新生成mRNA的可靠性。作者用4sU標記原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經細胞，其間用KCl激活這些細胞（15-120分鐘）（圖2a）。

作者首先將大腦皮層神經元聚類成不同細胞類型，包括興奮性神經元（Ex）、抑制性神經元 (Inh)、神經元前體細胞（NP）等（圖2b）。接下來他們分析了不同細胞類型中，ARGs基因中（如Jun和Npas4基因，圖2c）新（new RNAs，產生于4sU標記的2小時內）和舊（old RNAs，產生于2小時前）轉錄本在不同細胞類型中的表達水平。

這些ARGs的new RNAs在不同細胞類型中有不同程度的響應，而old RNAs沒有明顯響應（合成于4sU標記和神經元激活前），說明scNT-seq可以準確區(qū)分新舊轉錄本。

在準確區(qū)分新、舊轉錄本的基礎上，作者運用新近開發(fā)的Dynamo算法程序在興奮性神經元中進行了基于mRNA代謝標記的RNA velocity分析（圖2d右側），能準確捕獲神經元激活早期（0 – 15min）和晚期（30 – 120 min）的變化。

相較之下，傳統(tǒng)的RNA velocity利用已拼接（無內含子）和未拼接（有內含子）的轉錄本信息來間接地預測細胞中基因表達的變化趨勢。

由于Jun， Fos等早期響應基因內含子長度較短，基于內含子/外顯子定量的傳統(tǒng)RNA velocity方法無法準確估計這些基因的動態(tài)變化，因此無法鑒定到神經元激活早期（0 – 15min）的變化 (圖2d左側）。

而基于新生成轉錄本的RNA velocity能夠直接利用實驗準確定量的新、舊轉錄本的信息，推測mRNA的動態(tài)變化，不受基因結構（內含子比例）影響，兼具準確性和適用性。

細胞中RNA的豐度由轉錄、加工、降解等過程共同決定，準確測定細胞群體中稀有或動態(tài)變化的細胞類型中mRNA合成和降解速率是一個重要而充滿挑戰(zhàn)的問題。

前人的研究表明，小鼠胚胎干細胞存在不同的干細胞狀態(tài)，其中大約1%的細胞會自發(fā)轉變?yōu)榫哂懈叻只瘽摿Γ╰otipotent）的“2C-like”狀態(tài)（2-cell embryos like state）。

作者通過pulse-chase的標記策略結合scNT-seq技術測定了2616個基因在不同細胞狀態(tài)中的降解速率（half-life，圖3a，b）。

結合4小時4sU標記實驗，作者測定了445個差異表達基因的合成和降解速率。根據mRNA合成速率和降解速率在不同細胞狀態(tài)間變化的趨勢，這些基因可以劃分為3種不同的mRNA豐度調節(jié)策略（圖3c）。

有意思的是，即使采用同一種調控策略的基因，mRNA合成和降解對于不同基因mRNA豐度調節(jié)的貢獻也不盡相同。例如Tet1和Lefty2基因都采用“Destabilizing”策略（mRNA合成和降解速率同向變化），但是Tet1基因主要通過降低合成速率（synthesis rate）降低2C-like細胞中mRNA豐度，而Lefty2基因主要通過提高降解速率（degradation rate）降低2C-like細胞中mRNA豐度（圖3c）。

總的來說，scNT-seq是一種能在單細胞水平準確定量新生轉錄本的新技術。和已有的單細胞代謝標記分析方法[ref 3]相比，這項新技術兼具高準確度，高通量和低成本等優(yōu)勢。

因此，scNT-seq與Jay Shendure實驗室的曹俊越博士新近開發(fā)的sci-fate技術，都能夠廣泛應用于分析大量單細胞在細胞命運決定和分化，外界信號響應，及疾病模型等動態(tài)過程中mRNA表達調控等相關的重要生物學問題。

生命科學實驗中，離不開胎牛血清，胎牛血清 在細胞培養(yǎng)中的作用：

1. 提供對維持細胞指數生長的激素，基礎培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。

2. 提供結合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結合或調節(jié)它們所結合的物質活力。

3. 有些情況下結合蛋白質能與有毒金屬和熱原質結合，起到解毒作用。

4. 是細胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質上所需因子來源。

5. 起酸堿度緩沖液作用。

6. 提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。

7. 參與細胞凍存。

在細胞培養(yǎng)中，胎牛血清加入基礎培養(yǎng)基的濃度大多為5%～20%（常見見為10%）的。具體到不同試驗，應依據文獻報導，或細胞類型或基礎培養(yǎng)基的成分來確定標準濃度。

胎牛血清應在-20℃儲存，運輸應干冰冷鏈運輸，避免反復凍融，確保血清中因子活性不受影響，保證血清優(yōu)良品質。